Keratynocyty ludzkie w hodowli in vitro tworzą kolonie wywodzące się z komórek prekursorowych o różnym potencjale proliferacyjnym: mogą one two- rzyć holoklony powstające z komórek macierzystych naskórka oraz meroklony lub paraklony tworzone przez komórki progenitorowe o różnym stopniu zróżni- cowania. Obok formy kolonii tworzonych przez określone klony także kształt komórek może wskazywać na stopień ich zróżnicowania, o czym świadczą holoklony formowane przez małe i okrągłe komórki. Ze względów zarówno teoretycznych jak i klinicznych duże znaczenie ma możliwość odróżniania kera- tynocytów w zależności od stopnia ich zróżnicowania warunkującego właści- wości proliferacyjne.
Celem niniejszych badań było sprawdzenie, czy poszcze- gólne formy keratynocytów wykazują odmienną zdolność wiązania Helix po- matia agglutinin HPA (lektyna otrzymana ze ślimaka winniczka). Kierowano się tutaj spostrzeżeniem, że HPA wykazująca specyficzne powinowactwo do N- acetylo-galaktozaminy wiąże się najsilniej (na skrawkach histologicznych) do komórek warstwy ziarnistej i kolczystej naskórka. W przeprowadzonych bada- niach zamierzano również ustalić czy istnieje zależność między powinowac- twem keratynocytów do HPA a ich morfologią i klonogennością, co mogłoby być przydatnym do ewentualnego izolowania subpopulacji tych komórek.
Doświadczenia przeprowadzono na keratynocytach otrzymanych ze zdrowej skóry ludzkiej. Komórki izolowano przy pomocy dyspazy (Boehringer) w stężeniu 0,25% a następnie trypsyny 0,25% z EDTA 0,02%. Namnażano w odżywce płynnej Keratinocyte Growth Medium (Clonetics) na kolagenowanych płytkach hodowlanych (Nunc). Komórki znakowano lektyną Helix pomatia sprzężoną z FITC (Sigma) dodając ją do hodowli (10 µl/ml). Wiązanie HPA przez komórki oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym Eclipse TE200 (Nikon) oraz konfo- kalnym Axiovert 100 (Zeiss). Powinowactwo hodowanych keratynocytów do HPA określano również po traktowaniu ich neuraminidazą (8 µg/ml) oraz w hodowlach które osiągnęły konfluencję.
W wyniku przeprowadzonych badań wykazano występowanie określonych wzorów wyznakowania lektyną charakte- rystycznych dla morfologicznie odmiennych typów komórek. Cechowały się one następująco: 1) wiązaniem HPA na całej powierzchni komórki, 2) punkto- wym gromadzeniem się miejsc wiążących badaną lektynę, 3) występowaniem reakcji z HPA w połączeniach międzykomórkowych. Nadmienić należy, że część badanych komórek nie wykazywała powinowactwa do stosowanego znacznika, oraz że w obrębie kolonii obok komórek wyznakowanych występo- wały również komórki nie posiadające tej właściwości. Stwierdzono także, że neuraminidaza może odsłaniać miejsca wiążące lektynę. Na podstawie prze- prowadzonych doświadczeń można wnosić, że (1) HPA nie wiąże się do komó- rek macierzystych naskórka, (2) ma powinowactwo do jego komórek progenito- rowych, oraz (3) może być przydatna do frakcjonowania keratynocytów.
Wyniki badań przedstawione zostały na VI Konferencji Cytometria w Diagnostyce Lekarskiej, Poznań 2005.