Problemem jest już sama izolacja z tkanki. Keratynocyty macierzyste znajdują się pomiędzy skórą właściwą, która jest mocna, ale przepuszczalna dla wody, a naskórkiem który jest delikatną hydrofobową błonką i przylega do skóry bardzo ściśle.
Obecnie do izolacji używam Dyspazy (Dispase; enzym z Bacillus polymyxa, który trawi dość selektywnie kolagen IV, i lamininę).
Protokoły izolacji które czytałem mówią,że po odtrawiemiu naskórka dyspazą (4oC, 14 h)należy jego warstwę bazalną potraktować trypsyną. Niedawno zauważyłem jednak że można to samo (keratynocyty w zawiesinie) osiągnąć ponownie umieszczając naskórek w dyspazie, o temp. 37oC. Po około 20 minutach wystarczy kilka mocniejszych wstrząśnięć i keratynocyty już pływają. Korzystnie dla aseptyki jest przemyć przez wytrząsanie w PBS-ie naskórek po oddzieleniu, a przed trawieniem.
Uwaga! Nie należy długo trzymać nie wysianych keratynocytów. Brak kontaktu z podłożem jest dla tych komórek sygnałem do różnicowania. Z drugiej strony, po wysianiu żywotne komórki przyczepiają się po ok. 20 min. do płytki. Po czasie pół godziny można już płytkę delikatnie przemyć i wierzyć, że to co wartościowe zostało przyczepione. (Dla pewności lepiej jednak zostawić zawiesinę na noc, jeśli nie widać zbyt wielu bakterii).
Po wirowaniu zawiesiny komórek, tuż po trawieniu trypsyną, często spotykałem w probówce wirowaty, włókienkowaty twór, który był zakotwiczony w osadzie komórek na dnie probówki. Utrudniało to niesłychanie wydobycie samych komórek. Wyjęte zaś z tymi włókienkami po wysianiu zostawały w nich zawieszone i nie opadały na dno płytki. Podejrzewam, że winowajcą jest niedotrawiony kolagen IV błony podstawnej przemycany na odwarstwionym naskórku. Jest to kolejny czynnik przemawiający za użyciem Dyspazy do trawienia desmosomów (dysocjacja komórek warstwy bazalnej) . Niszczy ona resztki kolagenu IV szybko w temp. 37oC.
Wszystkie płyny używane przy izolacji i później przy hodowli muszą być nisko wapniowe. Wysoki poziom Ca++ sprzyja bowiem różnicowaniu keratynocytów, a tego nie chcemy. (Dziękuję Pani dr J. Drukale) Należy używać płytek kolagenowanych,lub pokryć płytkę warstewką surowicy i wysuszyć. Keratynocyty same wytwarzają sobie substancję podstawową. Jest istotne jednak, aby dostarczyć im szybko po wysianiu podłoża do którego łatwo przylgną.
Zastanawiałem się jak można by się dostać do warstwy bazalnej naskórka drogą inna niż enzymatyczna.
Usłyszałem o "Suction Blister". Spróbowałem na własnyn przedramieniu. obciąłem koniec strzykawki 20-stki , odwróciłem tłoczek, przystawiłem do skóry (wygolonej:) ) tąstroną gdzie zazwyczaj tłoczek wchodzi i zassałem na ok 2h. Przerwy były krótkie, na odtworzenie podciśnienia. Bąbel powstał duży, skóra obficie sączyła płynem śródmiąższowym, ale splitu nie udało mi się uzyskać:(. Jedynie kilka malutkich pęcherzyków.
Próbowałem też na bioptacie o pow. ok 24 cm2. Tu też nic nie wskórałem.
Zdjęcia:
1
2
3
4
5
